一、實驗?zāi)康?/span>

   1.學(xué)習(xí)紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)含量的原理。

   2.掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)。

   3.掌握TU-1901紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。

二、實驗原理

    1.紫外-可見分光光度計，是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。

紫外光：10-400 nm

可見光：400-780 nm（可被人們的眼睛所感覺）

特點：帶光譜、分子光譜

應(yīng)用：定性分析-zui大吸收波長；

      定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）

a.定性分析原理：

  吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對強(qiáng)度以及吸收峰的形狀.

  b.定量分析原理：

    根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。

    定量分析常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法即只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。

c.儀器組成部件:

    各種類型的紫外-可見分光光度計，如下圖所示，從總體上來說是由五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示記錄裝置。

   2.本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗原理：

（1）蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275--280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在zui大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

（2）此種方法測量的準(zhǔn)確度差一點的原因：由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測量的準(zhǔn)確度差一點。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測量蛋白質(zhì)含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算：

               蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

    （A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值）

        還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：

               蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

 其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子

（4）稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定的經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200—250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強(qiáng)。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式：

                蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值

三、儀器與試劑

    儀器：TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管（10ml的5個），吸量管。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液（牛血清白蛋白）。

四、實驗步驟

   1.基本操作

    （1）啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時。

    （2）用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）.

    （3）在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描）

    （4）將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調(diào)回光譜掃描。

2.吸收曲線的制作:（找出zui大吸收波長）

     將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點擊START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的zui大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為0.1984。

   3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

     在工作界面上選擇測量項目為光度測量設(shè)置測量條件（測量波長：278.00 nm）。

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，記錄如下：

濃度（mg/mL）
 

0.3
 

0.4
 

0.5
 

0.6
 

0.7
 
 

A278
 

0.1971
 

0.2532
 

0.3222
 

0.3758
 

0.4382
 

 以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

    4.樣品測定：

      配制三份待測蛋白質(zhì)溶液，（取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。

五、注意事項

準(zhǔn)備工作：

（1）在測量前應(yīng)把機(jī)器預(yù)熱半小時。

（2）溶液一定要配制準(zhǔn)確,以防影響實驗效果,保證點在一條直線上。

（3）由于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變，故進(jìn)行樣品測定時的PH與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的PH值一致。

測量工作：

（1）吸收曲線繪制前必須進(jìn)行光譜的掃描。

（2）.在作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量前一定要選擇zui大的吸收波長,確保靈敏度高。

（3）在實際操作中，比色皿在使用中應(yīng)注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。

六、思考題

1. 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的方法有何缺點及優(yōu)點？受哪些因素的影響和限制？

答：優(yōu)點：方法操作簡便、迅速、不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，不消耗樣品，測定后仍能回收使用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶液不干擾測定。

    缺點：準(zhǔn)確度和靈敏度差一點。干擾物質(zhì)多：對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會產(chǎn)生較大干擾

2. 若樣品中含有核酸類雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？

 答：因為核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算：

          蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

  （A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值）

  還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：

             蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d